O intuito principal destas publicações é compartilhar informações, ainda pouco conhecidas pela maioria das pessoas, a respeito dos bioprodutos e a contribuição destes produtos para o aumento da disponibilidade de alimentos saudáveis e segurança alimentar em todo planeta. Todo o conteúdo abordado nestas publicações, integrará o conhecimento científico com abordagens e informações relevantes para as empresas e instituições envolvidas diretamente com a biofabricação e comercialização de agentes biológicos no Brasil.

A ideia central desta iniciativa é demonstrar a importância dos insumos biológicos e o seu impacto em nossas vidas. Do consumidor “ainda leigo neste assunto”, passando pelos técnicos e agricultores diretamente ligados ao setor, até o varejo, que está cada vez mais conectado com as práticas empregadas em campo.

Só um consumidor bem informado é capaz de mudar o mundo para melhor

A proposta destas publicações é impulsionar à adesão do controle biológico de forma integrada a outras táticas de manejo adotadas pelo agricultor, mas não podemos parar no campo. É necessário expandir e levar o conhecimento até a gôndola dos supermercados.

Então vamos lá …

AGENTES MICROBIANOS DE CONTROLE

Os microbiológicos representam pouco mais do que 70% dos produtos registrados junto aos órgãos competentes para a comercialização no país. Dentre esses, os fungos à base de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Trichoderma harzianum representam cerca de 60% dos registros de biodefensivos à base de microbiológicos no Brasil, seguidos pelas bactérias entomopatogênicas, como Bacillus thurigiensis e Bacillus subtilis, e os vírus entomopatogênicos, tal como Baculovirus spodoptera, produto registrado e utilizado especificamente para o controle da lagarta do cartucho do milho.

FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS

Como esses Microrganimos agem?

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Estes organismos têm uma grande versatilidade podendo infectar, por contato, diferentes ordens de insetos e ácaros, e vários estágios de desenvolvimento dos hospedeiros. Após a aplicação do produto comercial em campo, a infecção é iniciada através da adesão e germinação dos conídios na superfície externa do corpo do inseto-alvo.

Sob condições adequadas de temperatura e humidade, os esporos germinam, desenvolvem suas hifas e colonizam a cutícula do inseto. Em seguida perfuram-na e atingem a sua cavidade corporal. Inicia-se então a sua multiplicação dentro do hospedeiro e a produção de toxinas que aos poucos paralisará o metabolismo do alvo, levando-o a morte.

A colonização completa do corpo do hospedeiro e sua mumificação geralmente acontece em uma semana. E seguida, inicia-se a esporulação e disseminação do fungo a partir dos insetos mumificados para o meio ambiente e consequentemente a contaminação de outros hospedeiros, continuando o ciclo do entomopatógeno.

Fungos Benéficos: Da Bioprospecção a Biofabricação

O início do processo para a produção de fungos entomopatogênicos geralmente é feito através de projetos de bioprospecção e coleta de amostras em campo. No entanto, é extremamente importante que o pesquisador solicite autorização de licença de coleta junto aos órgãos competentes. A coleta e transporte deste tipo de organismo sem a correta autorização é expressamente proibida. Com esta licença em mãos, pode-se iniciar a bioprospecção. Após a coleta de um determinado inseto, contaminado com o entomopatógeno, realiza-se em laboratório os processos de isolamento, identificação, caracterização e seleção de isolados com melhor desempenho para o controle da praga-alvo. Existem instituições que mantém coleções de isolados de fungos entomopatogênicos como é o caso do Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico, em Campinas, referência no suporte para programas de controle microbiano, por meio do intercâmbio de isolados ou insetos mortos com microrganismos entomopatogênicos.

Após a seleção do isolado obtido a partir de coletas realizadas em campo, ou de coleções estabelecidas por instituições devidamente credenciadas pelos órgãos competentes, inicia-se a multiplicação dos propágulos infectivos, que pode ser realizada através de processos fermentativos em meios líquidos, sólidos, semi-sólidos ou através da associação dos meios líquidos e sólidos, fermentação bifásica. A fermentação mais utilizada para a produção industrial de fungos em biofábricas acontece em meio sólido, empregando-se substratos compostos de sementes de gramíneas (ex. arroz) esterilizadas. Este tipo de fermentação é mais adequada para os fungos que produzem conídios aéreos, como Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana. Uma das grandes vantagens do processo de fermentação sólida é o controle da contaminação, que pode ser realizado através do manejo das condições bióticas e abióticas favoráveis para o desenvolvimento do entomopatógeno

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Foto: Metarhizium (=Nomuraea) riley. Fonte: EMBRAPA

Microvespas carregando Microbiológicos

Um dos fungos entomopatogênicos mais comercializados no Brasil é a Beauveria bassiana, um microrganismo que pode ser encontrado em amostras de solos ou contaminando insetos em seus habitats naturais. Beauveria bassiana tem sido utilizado para o controle de uma ampla gama de alvos na agricultura, tais como: broca-do-café, mosca-branca, brasileirinho (larva alfinete), moleque-da-bananeira, bicudo-da-cana, psilídeo-dos-citrus dentre outras. Experimentalmente, isolados de Beauveria bassiana foram validados para o controle biológico da broca-da-cana, aplicados isoladamente, e em outros testes em associação com o macrobiológico Cotesia flavipes. Recentemente uma startup realizou alguns estudos em campo, utilizando a Cotesia contaminada com Beauveria bassiana.

Nesse caso, a ideia é utilizar o agente macrobiológico como um “vetor” que carregará o entomopatógeno até o alvo.

Atualmente pouco mais do que trinta biodefensivos contendo o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana possuem registro para a comercialização no país, sendo que a grande maioria desses produtos contém os isolados IBCB 66 ou CBMAI 1306, ambos registrados como insumo para a agricultura orgânica. O primeiro isolado é proveniente da Coleção de Micro-organismos Entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu” do Instituto Biológico e o segundo da Coleção Brasileira de Microrganismos de Ambiente e Indústria, localizada no CPQBA/UNICAMP, ambas coleções localizadas em Campinas. O registro dos biológicos como insumo para a agricultura orgânica certamente estimulou o crescimento do número de empresas dedicadas a produção e comercialização de bioinsumos para o controle biológico de pragas no Brasil. No entanto, é importante salientar que as biofábricas que optam por esse caminho para registrar seus produtos, devem seguir de maneira fidedigna as especificações de referências publicadas no DOU, restritas aos alvos e isolados que constam nas referidas publicações.

A muscardina verde é um sucesso no controle biológico em cana-de-açúcar

O fungo Metarhizium anisopliae, também conhecido como muscardina verde devido a sua coloração esverdeada, é um dos microbiológicos mais comercializados no país.

Da mesma forma que Beauveria bassiana, esse agente biológico também pode ser encontrado em amostras de solos ou contaminando insetos em seus mais diversos habitats naturais. Atualmente o principal isolado comercializado no Brasil é o IBCB 425, proveniente da Coleção de Microrganismos Entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu” do Instituto Biológico (Campinas). Metarhizium anisopliae tem sido utilizado para o controle das cigarrinhas Deois flavopicta, Zulia entreriana, Mahanarva fimbriolata, e em mistura com Beauveria bassiana também tem sido recomendado para o manejo biológico de broca do café (Hypothenemus hampei), mosca-branca (Bemisia tabaci raça B), e percevejo marron da soja (Euchistus heros). O primeiro registro de um produto comercial contendo Metarhizium aconteceu há pouco menos de 10 anos. No entanto, esse fungo tem sido empregado por usinas de cana-de-açúcar para o controle de cigarrinhas há décadas.

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Controle biológico de Fitopatógenos com Fungos Benéficos

O Trichoderma pode ser encontrado nos solos, geralmente associado às raízes das plantas e material vegetal em decomposição. Devido ao sucesso em seu processo de colonização, esse fungo ganha a competição com fitopatógenos contribuindo com a sanidade das culturas. Alguns isolados têm sido empregados para o controle de fungos de solo que atacam as raízes, caules e o sistema vascular das plantas. Outros podem controlar doenças, como Botrytis cinerea, que atacam a parte aérea da planta. A competição impede que o patógeno entre em contato com a planta, inibindo a contaminação. O Trichoderma também pode ter ação direta sobre fitopatógenos ou indireta, através da produção de substâncias que inibem o desenvolvimento e multiplicação destes. Algumas empresas recomendam a aplicação de “vacinas” de Trichoderma ainda nos viveiros, pouco antes do transplantio, para que neste caso o fungo funcione como um “indutor de resistência”.

A produção de metabólitos secundários também contribui com o sucesso do Trichoderma para o controle biológico de fitopatógenos. Apesar de não exercerem um papel fundamental no crescimento e desenvolvimento do fungo, os metabólitos secundários são importantes na colonização de habitats, oferecendo vantagem no processo de colonização do mesmo.

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Pode-se dizer que a ampla diversidade de metabólitos secundários relaciona-se com a grande variabilidade de pragas-alvo que o gênero Trichoderma consegue controlar. A espécie Trichoderma harzianum é a mais comercializada mundialmente. No Brasil, até dezembro de 2019 cerca de 70% dos bioprodutos registrados contendo esse agente microbiológico pertenciam a essa espécie, sendo comercializados para o controle dos seguintes fitopatógenos: Sclerotinia sclerotiorum (mofo-branco), Rhizoctonia solani (podridão radicular), Fusarium solani (fusariose), Thielaviopsis paradoxa (podridão abacaxi ou podridão negra) e para o controle do nematóide Pratylenchus zeae.

Quatro "Trichodermas" já foram transformados em bioinsumos no Brasil

A aplicação de Trichoderma pode ser feita nas sementes, no substrato (como vacina), no sulco de plantio ou em material orgânico em decomposição, comumente incorporado antes do transplante das mudas. Atualmente quatro espécies de Trichoderma possuem registro para a comercialização no Brasil, sendo: Trichoderma harzianum (principal), Trichoderma asperellum, Trichoderma koningiopsis, Trichoderma stromaticum. Os produtos comerciais à base deste fungo são ofertados no mercado nas seguintes formulações: Concentrado Emulsionável (EC), Gel Emulsionável (GL), Suspensão Concentrada (SC), Pó Molhável (WP) e Granulado Dispersível (WG). Importante destacar que para manter a alta viabilidade dos esporos ou conídios, faz-se necessário a conservação a frio ou por armazenamento em baixas temperaturas e ambiente adequado. Trichoderma asperellum é a segunda espécie com maior número de produtos registrados (5) no Brasil (ref. 27/12/19), para o controle de Rhizoctonia solani, Fusarium solani f.sp. Phaseoli e Sclerotinia sclerotiorum.

Uma alternativa para o controle biológico de nematóides

O fungo entomopatogêncio Paecilomyces lilacinus é um parasita facultativo de ovos de nematóides, encontrado em diferentes regiões e tipos de solos brasileiros. Seu processo de infecção ocorre a partir do crescimento das suas hifas sobre a gelatina que recobre a massa de ovos do nematoide (foto).

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Foto: Jonathan D. Eisenback, Virginia Polytechnic Institute and State University, Bugwood.org

A colonização dos ovos aparentemente ocorre pela simples penetração da parede do ovo por uma hifa individual, auxiliada por atividades mecânicas e/ou enzimáticas. Após a penetração, em curto espaço de tempo, os ovos são completamente colonizados pelo fungo, ocorrendo o controle biológico desta praga. Até o final de 2019, seis bioprodutos contendo Paecilomyces lilacinus possuíam registro para comercialização, junto aos órgãos competentes, para os seguintes alvos: Meloidogyne incognita, Meloidogyne javanica e Pratylenchus brachyurus.

BACTÉRIAS NO CONTROLE BIOLÓGICO

As Bactérias Benéficas são Importantes Componentes no Manejo Integrado de Pragas

Dentre as bactérias utilizadas como agentes biológicos destacam-se aquelas do gênero Bacillus. Apresentam ocorrência bastante generalizada e ampla, sendo encontradas em diversas regiões em todo o mundo. São encontradas no solo, parte aérea de plantas, região das raízes, grãos armazenados, insetos mortos, dentre outros. São bactérias do tipo Gram-positivas e aeróbicas, podendo facultativamente crescer em anaerobiose. Todas as espécies do gênero Bacillus produzem endósporos (Bacillus thuringiensis, Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus moycoides e Bacillus weihenstephanensis). Esse conjunto é responsável por mais de 90% dos bioprodutos à base de microrganismos comercializados em todo o mundo.

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As espécies desse grupo são muito semelhantes, sendo a principal característica que distingue por exemplo, Bacillus thuringiensis, principal bactéria comercializada como agente biológico de controle, dos outros gêneros é a presença intracelular de um cristal proteico.

A bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) é um dos principais agentes microbiológicos comercializados no Brasil e em diversos países. A sua atividade inseticida está relacionada com a presença de inclusões proteicas cristalinas conhecidas como delta endotoxinas, as quais são produzidas no momento da esporulação. Essas toxinas são inofensivas para os seres humanos, demais vertebrados e meio ambiente.

Atualmente as mais utilizadas são as toxinas Cry, as quais apresentam um amplo espectro de ação, sendo efetivas para diversas ordens de insetos, podendo ser utilizada para o controle biológico de lagartas, mosquitos, besouros, dentre outros. As proteínas Cry são sintetizadas na forma de protoxinas, sendo que sua ação depende de processos de ativação que ocorrem no interior do aparelho digestivo do inseto. Essa bactéria produz diversos tipos de toxinas, com ação inseticida, tais como as δ-endotoxinas, α-exotoxina, β-exotoxina, VIP e SIP.

O processo de contaminação da praga-alvo com Bt

Os cristais de Bacillus thuringiensis (Bt), também conhecidos como proteínas Cry, são formados principalmente por proteínas na forma de cristais, as δ-endotoxinas. As proteínas Cry são consideradas as principais constituintes dos cristais que caracterizam Bacillus thuringiensis, sendo codificadas por genes que geralmente se localizam em plasmídios e, com menor frequência, no cromossomo bacteriano. O processo de contaminação da praga-alvo com Bt ocorre pela ingestão da folha contaminada com a bactéria. A toxina se une a receptores presentes no intestino médio do inseto, em seguida o inseto deixa de se alimentar e perde a mobilidade. O intestino se rompe e os esporos penetram em seu corpo. O inseto morre por septicemia, estado infeccioso generalizado, e os esporos germinam no corpo do inseto. Os sintomas da intoxicação do inseto pela ingestão do Bt são a perda do apetite e abandono do alimento, regurgitação e diarréia, perda de mobilidade, paralisia em um período de 18 a 72 horas, tegumento sem brilho a marrom escuro.

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A Bactéria que agrega multifunções

Bacillus subtilis é outra bactéria que tem ganhado importante projeção e destaque como agente de controle biológico e promotor de crescimento de plantas. Este microrganismo faz parte do grupo das rizobactérias promotoras do crescimento de plantas (RPCPs), sendo encontrada com frequência em diferentes tipos de solo, geralmente próximo do sistema radicular das plantas. O efeito deste microrganismo sobre diferentes patógenos de plantas acontece usualmente através de processo de antibiose. Neste caso este agente benéfico libera no microambiente em que ocupa, substâncias que inibem o desenvolvimento de organismos que competem com a mesma por espaço e nutrientes. Recentemente tem se observado, isolados desta bactéria produzindo grande variedade de metabólitos antifúngicos e outros com efeito no controle de algumas espécies de nematóides como Meloidogyne spp. Indiretamente o efeito de Bacillus subtilis também se dá através da resistência induzida, podendo proteger a planta de maneira sistêmica.

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OS VÍRUS DO BEM

Os Vírus também Contribuem para o Controle Biológico Aplicado

Os baculovírus são os vírus entomopatogênicos mais estudados e os mais utilizados para o controle biológico de pragas. Atacam exclusivamente os insetos, sendo seguros ao homem, meio ambiente e compatíveis com outros métodos de controle de pragas. Estes vírus contêm DNA circular de fita dupla com material genético e são caracterizados pelos nucleocapsídeos de vírus infecciosos que se encontram dentro de uma matriz proteica auxiliando-o para a sobrevivência fora de seu hospedeiro. A contaminação do inseto se dá através da ingestão das partículas virais dispersas sobre as plantas após o tratamento. O pH alcalino do intestino médio do inseto rompe a matriz proteica do vírus, liberando os vírions, suas proteínas se ligam às proteínas presentes nas membranas das células epiteliais do intestino do inseto.

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Os nucleocapsídeos se deslocam pelo citoplasma celular, penetram no núcleo da célula, onde liberam o DNA viral, iniciando a transcrição dos genes e replicação do genoma do vírus.

O modelo mais comum para a biofabricação do baculovirus é através da produção in vivo em quatro etapas: (1) produção massal do hospedeiro sadio; (2) infecção do hospedeiro sadio com o vírus; (3) coleta e armazenamento do hospedeiro infectado após a morte; (4) preparo do bioproduto para aplicação em campo.

Uma das partes mais importantes durante o processo de produção é a infecção do hospedeiro sadio pelo vírus, sendo que o isolado utilizado pode ser purificado ou não. Qualquer falha na infecção, higienização e controle da climatização interna da sala de criação do hospedeiro infectado pode comprometer todo o lote a ser produzido. Alguns isolados de baculovirus não rompem o tegumento do inseto após a contaminação, sendo essa uma característica que apesar de facilitar o manuseio do inseto contaminado no sistema de produção em laboratório, pode retardar o processo de transmissão horizontal em campo, sendo que nesse caso a epizotia ocorre de maneira mais lenta do que para os isolados que rompem o tegumento do inseto.

NEMATÓIDES ENTOMOPATOGÊNICOS

Quem esses Seres Notáveis?

Em determinados ambientes, os nematoides constituem a maior parte da microfauna do solo. A biodiversidade de tipos de nematoides é ampla, abrangendo desde os fitopatogênicos até espécies de nematoides benéficos, conhecidos como NEPs – nematoides entomopatogênicos. Os três gêneros de nematóides entomopatogênicos mais conhecidos são: Steinernema, Neosteinernema e Heterorhabditis. Estes nematoides carregam bactérias simbióticas que infectam o hospedeiro, assim como os nematoides, causando a sua morte e alimentando-se das reservas do inseto morto. Ao serem introduzidas no interior da hemocele do inseto pelo nematoide, as células bacterianas são liberadas na hemolinfa, onde excretam toxinas, que matam o inseto em um curto período de 1 a 2 dias.Os NEPs podem penetrar na hemocele do hospedeiro através da cutícula, através da parede do intestino passando pelo ânus ou boca e através da cutícula traqueal pelos espiráculos.

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As bactérias apresentam estreita relação com o nematoide entomopatogênico, sendo que as bactérias do gênero Xenorhabdus são simbiontes dos nematoides do gênero Steinernema, enquanto que as do gênero Photorhabdus são simbiontes dos nematoides do gênero Heterorhabditis. O juvenil de terceiro estágio, formas infectivas de Steinernema e Heterorhabditis, não se alimenta e carrega suas bactérias mutualísticas específicas no intestino. Os juvenis infectivos entram em seus insetos hospedeiros através das aberturas naturais tal como boca, ânus e espiráculos, penetrando no hemocele. No caso específico de Heterorhabditis, os juvenis infectivos podem penetrar também diretamente pelo tegumento. Dentro do hemocele, os juvenis liberam células da bactéria que se propaga e mata o hospedeiro em 2 dias. Os NEPs se alimentam da bactéria e tecido hospedeiro, se reproduzem por 2 a 3 gerações e emergem dos insetos mortos como juvenis infectivos para a procura de novos hospedeiros.

Os nematóides entomopatogênicos Steinernema spp. e Heterorhabditis spp. têm sido multiplicados “in vivo” e “in vitro”, sendo a primeira forma empregada para menor escala de produção e a segunda para maior escala, visando desde experimentos de campo à fabricação em biofábricas. Comumente o uso de lagartas de Galleria mellonella tem sido empregado para a produção “in vivo”, sendo a forma mais usada para a manutenção do nematóide em laboratório, para a produção comercial em biofábricas. A produção “in vitro” é realizada com o cultivo envolvendo apenas o nematóide como organismo, envolvendo o nematóide em associação com a bactéria simbionte. Dentre os métodos de produção “in vitro” destacam‐se os processos da esponja (meio sólido) e de fermentação (meio líquido), os quais podem permitir elevados rendimentos do nematóide.

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